放疗是运用最为广泛的基因毒性癌症疗法。放射线所具有的能量会导致细胞DNA损伤，包括DNA双链断裂（DSB）、单链断裂（SSB）和链间交联，从而阻断DNA复制和转录等，造成细胞死亡[1]。

由于G1/S检查点关键调控因子p53的存在，正常细胞在DNA损伤后将停滞在G1期（DNA合成前期），不进入S期（DNA合成期），并启动DNA损伤修复机制。但在肿瘤细胞中，G1/S检查点调控因子往往失去作用，使得肿瘤细胞很容易进入S期，因此放疗导致的DNA损伤是肿瘤细胞的致命“毒药”[2]。

而在临床中，有许多肿瘤对放疗不敏感。因此，“狡猾的”肿瘤细胞必定在进入DNA合成期（S）之后，进入分裂期（M）之前（即G2期），找到了救命的办法。

近日，丹麦哥本哈根大学Claus S. Sørensen教授领衔的团队在《科学》杂志发表重磅研究成果，帮我们揭开了谜团。

他们发现，肿瘤细胞在DNA被放射线破坏之后，会招募一种核酸酶（CAD）到DNA损伤处，主动切断自身特定位点的DNA，阻止复制分裂的进行，使得肿瘤细胞停滞在G2期（DNA合成后期），为修复放疗导致的DNA损伤赢得宝贵时间[3]。

这一颠覆性的研究，证实了肿瘤细胞在放射性DNA损伤的压力下，存在一种“剑走偏锋”的自救方式，并为改善放疗效果提供了新的思路和靶点。

其实在十余年前，就有科学家发现在接受放疗后，除了最开始的一波DNA损伤，细胞还存在第二波DNA损伤[4]，而造成这波延迟DNA损伤的原因一直不是很明确。

为了寻找放疗后由DNA损伤诱导的G2/M检查点调控因子，研究人员通过高通量siRNA对肿瘤细胞中已知的人核酸酶文库进行筛选。筛选出排名第一的因子为RBBP8，一个已知的G2/M检查点因子。

出乎意料的是，排第二的因子是CAD（CAD是参与细胞凋亡过程中DNA断裂的核酸酶，作为caspase信号级联反应的效应者），一个之前被认为与DNA损伤反应或细胞周期检查点调控无关的因子。

高通量siRNA对肿瘤细胞中已知的人核酸酶文库进行筛选

CAD的出现引起了Sørensen和他同事的注意，他们猜测核酸酶CAD可能就是导致放疗后细胞发生延迟DNA损伤的幕后主使，而且它能通过某种机制充当DNA损伤诱导的G2/M检查点调控因子。

为了验证这一点，研究人员对野生型和CAD-KO的人结直肠癌细胞HCT116进行放射性照射，发现野生型和CAD-KO细胞在照射后早期（10min-6h）的DNA损伤相似，但在24小时后，野生型细胞出现了远高于CAD-KO细胞的DNA损伤。这说明放疗后的延迟DNA损伤很可能就是CAD介导的。

在接受放射24小时后，野生型细胞出现了远高于CAD-KO细胞的DNA损伤

已有研究表明，在细胞中，CAD的激活通常是由caspase-3介导，它将CAD与ICAD（CAD抑制蛋白）分离，使CAD二聚化，进而裂解DNA。

然而，研究人员并没有观察到放疗后caspase-3激活和ICAD蛋白水解的证据。此外，泛-caspase抑制剂也并不能抑制DNA的延迟损伤。这表明放疗后CAD的激活方式并非是依赖于caspase-3的经典途径。

通过研究，Sørensen团队发现，在DNA损伤反应的介导下，CAD和ICAD都被招募到DNA断裂的区域。而ATM和ATR激酶（介导DNA损伤反应）活性的抑制或丧失可限制CAD/ICAD的招募，使得DNA断裂减少。

通过蛋白质序列分析，研究人员发现ICAD上存在可被ATM/ATR磷酸化的两个高度保守的位点（Ser107和Ser257），并通过针对Ser107和Ser257位点设计的ICAD磷酸化特异性抗体，验证了这两个位点在细胞受到放射性照射后都出现了广泛的磷酸化，且磷酸化程度取决于ATM和ATR激酶的活性。

ICAD上存在可被ATM/ATR磷酸化的两个高度保守的位点（Ser107和Ser257）

接着，研究人员设计了相应位点不能磷酸化的ICAD丝氨酸-丙氨酸突变细胞（S107A和S257A），以研究ICAD磷酸化的功能。将突变细胞放射性照射后，突变的ICAD不能稳定地被招募到DNA损伤区。

以上结果表明，依赖于ATR/ATM的ICAD的磷酸化是导致CAD/ICAD被招募到DNA损伤区的关键。

但问题来了，当CAD与ICAD结合时，其功能是受到抑制的啊？怎么还会导致DNA断裂呢？

原来是因为CAD与ICAD结合时，其发挥DNA酶作用的结构域仍然暴露在外。而常规情况下，CAD/ICAD二聚体是不会聚集在DNA区的，但当受到放射刺激后，DNA损伤反应使ICAD磷酸化，将CAD/ICAD招募到DNA损伤区，介导DNA断裂。

DNA损伤后使CAD/ICAD招募到DNA损伤区，介导DNA断裂

通过进一步研究，Claus S. Sørensen教授团队发现CAD介导的DNA断裂是在特定位点（位于染色质修饰的CCCTC结合因子位点附近）进行的，而非随机分布于基因组中。这也从侧面反应了这种自主的DNA断裂是肿瘤细胞有“预谋”的进行的。

损伤的DNA位于特定位点（位于染色质修饰的CCCTC结合因子位点附近）

紧接着，研究人员探究了CAD是如何使肿瘤细胞停滞在G2期，而不进入M期。他们发现在CAD介导细胞DNA断裂后，细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶CDK1的抑制性磷酸化（Tyr15）减少，活化的检查点因子CHK2减少，导致了细胞停滞在G2期。

不过，CAD对正常细胞的G2/M期的进行并不会有明显影响，因为正常细胞拥有正常的p53和pRB通路，即有完善的G1/S检查点，因此减少了对G2/M检查点的依赖。

最后，研究人员通过使用人肿瘤异种移植小鼠模型在体内评估放射治疗中CAD的功能。与细胞中的研究一致，相比于CAD野生型肿瘤，CAD功能缺陷肿瘤中对放射治疗更敏感。

相比于CAD野生型肿瘤，CAD功能缺陷肿瘤中对放射治疗更敏感

总的来说，该研究发现并证实了肿瘤细胞在受到放疗后的一种独特的自救模式。在遭遇放疗导致的DNA损伤后，肿瘤细胞中的CAD/ICAD在DNA损伤反应的介导下被招募到DNA损伤区，引发基因组中特定位点的DNA断裂。

虽然DNA断裂对细胞来说通常是个坏消息，但肿瘤细胞可能是在自主制造一些简单易于修复的DNA损伤，使分裂旺盛的肿瘤细胞停滞在G2期，从而获得足够的时间来修复放疗带来的DNA损伤。可能这就是所谓的“大局观”吧。

希望这一发现能帮助科学家找到肿瘤对放疗耐受的解决方案，让放疗变得更有效。